对液相色谱来说，色谱柱是核心。对分离纯化来说，一根高效、稳定的色谱柱是关键。分离纯化不同样品，需要用到不同的柱子，今天小编想跟大家聊一聊C18反相分离柱。

C18反相分离柱

C18是连接十八烷基碳链的反相固定相的总称。除了常见的硅胶为基质外，高聚物小球、氧化铝、氧化锆等为基质键合C18链形成的反相固定相,都可以称为" C18"。C18的种类有很多,常见的硅胶基质C18通常被称为ODS，能在纯水下运行的C18则被称为C18-AQ。

C18反相柱的固定相是非极性固定相，流动相极性大于固定相极性，常用溶剂一般为水和甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇等与水互溶的溶剂，适应于分离非极性或弱极性的化合物，其样品洗脱顺序为样品极性由高到低。

图1.常规C18柱硅胶表面结合相示意图

C18反相分离柱应用范围

C18反相分离柱广泛应用在天然产物提取、医药合成研发以及生物制药等多个方向。如果您的样品极性偏大、Rf值很近，正相模式无法分开；终产物要求纯度98%以上、采用正相模式无法达到；在正相条件存在溶解问题的样品——以上情况不妨考虑采用反相C18模式进行分离。目前C18柱因其填料键合技术的成熟和出色的分离能力，已成为分离纯化研究人员日常接触最多的反相柱。

C18反相分离柱的主要参数

      C18分离柱的参数有很多，大致分为四个方面：键合相（包括修饰、封端）、填料载体（硅胶纯度、填料颗粒类型、粒径、孔径）、柱子本身（柱效、柱内径、柱长）和隐藏参数（比表面积、含碳量等）。无厘头的小编想挑选以下几个大家容易忽视的方面进行介绍。

1、碳含量

碳含量即填料中的含碳量，侧面反映C18的修饰程度，对分离效果及目标组分的保留时间起到重要作用。对同类型的填料而言，非极性化合物在含碳量高的柱子上的保留要大于低碳含量的柱子，碳链增长了，也增加了键合相的非极性作用面积。

不同的键合工艺决定了C18的碳含量，一般市面上C18碳含量在17-22%不等，也有些特殊C18的碳含量超过22%和低于14%的C18填料。大多数样品选择普通碳含量的C18就可以解决。含碳量也不是越多越好，要根据样品性质和纯化需要去挑选不同碳含量的C18，例如极性较大的化合物在碳含量高的C18保留情况不如含碳量低的C18。

2、基质形态、粒径、孔径

硅胶基质形态通常可以分为无定形和球形两种。无定形C18因其性价比高，可作为初步纯化的首选。而球形C18的颗粒均一性好，柱效更高，分离度更好，但相对价格可能稍高，可作为精细纯化的选择。

目前市场上可供选择的填料粒径有很多，中低压制备一般为了增大上样量、增加流速、减小压力选用大粒径填料；因为能达到较高的柱效，所以小粒径填料更适用于高效液相或高压制备。硅胶的孔径在选择填料时也应充分的考虑，分子量低于5000 Da时选择孔径（80-120Å），而对于蛋白大分子分子量20000Da左右左要选择大孔径（300Å），分子量大于20000Da的样品，通常不考虑C18分离模式，选用SEC等模式分离。

3、封端

载体硅胶上的硅羟基大部分都会参与键合反应，但是却不能反应完全，会有一些硅羟基裸露在外面。这些硅羟基会与极性组分起作用，使色谱峰拖尾，降低柱效。为了减少游离的硅羟基，会采用键合小分子的硅烷与之反应，这种叫做封端。一般采用封端技术的色谱柱，具有较高的重现性及耐久性，对于大多数的化合物都能有很好的分离能力。

C18反相分离柱使用中影响因素

根据样品情况选定C18反相分离柱，我们要通过改变流动相的组成或溶剂强度来改善样品的分离度、选择性或保留时间。

反相C18分离中，水能与许多有机溶剂混合，如水-甲醇、水-乙腈、水-四氢呋喃等，对不同的样品分离结果也千差万别。在流动相中加入适当的改良剂如三乙胺或乙酸，可以抑制硅胶表面残留的硅羟基的酸性，从而减少对酸或碱性组分的保留，减少拖尾；且调节流动相的PH，对酸性或碱性组分的选择性有很大改变。对于酸性组分来说，当流动相的PH＜7时，会增加在色谱柱上的保留时间；对于碱性样品来说，当流动相的PH≥7时，碱性组分为游离型（RNH₂），极性小、保留时间增长、在固定相与流动相之间可以多次分配，增加碱性组分的选择性。

通常，我们需要分离的混合样品性质很不同，很难通过调节PH就能达到要求。一般，在改变流动相PH的基础上，另加入缓冲盐来改变组分的选择性和分离度。在使用过程中，大部分C18反相分离柱须注意以下3个方面：

1、强酸强碱

以硅胶为载体的键合相填料，其使用要求为：流动相的PH值范围在2.5-7.5之间。当PH＜2时，流动相可能会与载体硅胶和键合相之间发生水解反应，使碳链丢失；当PH＞7时，流动相可能会使载体硅胶溶蚀。所以，硅胶基质的C18（即ODS）基本上在强碱条件下寿命较短，而聚合物C18能在较高碱性条件下稳定运行，但其价格昂贵且分离能力和机型强度都不如ODS。

2、纯水体系

键合相是非极性，碰到水会排斥C18链，从而使C18“倒伏”，色谱峰形变差，保留变弱，即水相塌陷现象，因此，大部分C18反相分离柱不能用100%纯水做流动相。通常选择C18-AQ反相分离柱分离亲水化合物，走纯水体系，提高保留值。

3、缓冲盐

由于分离组分的多样性，单纯使用酸或碱去调节流动相中的PH值不一定能达到实验想要的效果。通常的做法是：用缓冲盐配制流动相。但有一些缓冲盐会析出不易看到的细微晶体：如果过滤，会改变流动相的组成；不过滤，晶体会损伤柱子，也容易堵塞管道、污染检测器。因此，在满足实验的前提下，尽量选择不易析出的缓冲盐；分离结束后，务必将柱子及整个分离系统冲洗干净，避免色谱生长霉菌。为了方便制备后处理，通常选择一些易挥发的盐类，如铵盐。

目前，制备纯化C18反相分离柱的应用已经越来越普及，尚未尝试过的朋友可向三泰免费申请试用或免费开发反相纯化方案。

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